Kurze Antwort: Pipetten werden nach ISO 8655 gravimetrisch kalibriert. Dabei gibt die Pipette destilliertes Wasser ab, das auf einer Analysenwaage gewogen wird. Die Masse wird ueber den Z-Faktor in ein Volumen umgerechnet. Pro Pruefvolumen (in der Regel 100, 50 und 10 Prozent des Nennvolumens) werden zehn Wiegungen durchgefuehrt. Daraus ergeben sich der systematische Fehler (Richtigkeit) und der zufaellige Fehler (Wiederholpraezision), die mit den Fehlergrenzen der ISO 8655-2 verglichen werden. Liegen die Werte ausserhalb, wird die Pipette justiert.
Kolbenhubpipetten sind Praezisionsmessgeraete, die sich durch Verschleiss, undichte Kolben oder falsche Handhabung im Alltag veraendern. Damit sie zuverlaessig dosieren, muessen sie regelmaessig geprueft und kalibriert werden. Die massgebliche Norm dafuer ist DIN EN ISO 8655. Diese Anleitung erklaert die gravimetrische Methode Schritt fuer Schritt, inklusive Auswertung und Fehlergrenzen.
Was ist ISO 8655?
ISO 8655 ist die internationale Norm fuer kolbenbetriebene Volumenmessgeraete, also Pipetten, Bueretten, Dispenser und Dilutoren. Sie ist in mehrere Teile gegliedert: Teil 1 regelt die Begriffe und allgemeinen Anforderungen, Teil 2 die Kolbenhubpipetten, Teil 6 beschreibt die gravimetrische Referenzmethode. Die gravimetrische Methode gilt als Referenzverfahren, weil sie das abgegebene Volumen ueber eine ruecksfuehrbare Massebestimmung ermittelt.
Kalibrieren, justieren, Konformitaetspruefung
Drei Begriffe werden oft vermischt, meinen aber Unterschiedliches:
- Kalibrieren bestimmt die Abweichung der Pipette vom Sollwert.
- Justieren stellt das Geraet so ein, dass es wieder innerhalb der Grenzen liegt.
- Konformitaetspruefung prueft, ob die Pipette die Fehlergrenzen der ISO 8655 einhaelt.
Kalibrieren stellt also fest, justieren korrigiert. In der Praxis folgt auf eine Kalibrierung bei Bedarf eine Justage und eine erneute Pruefung.
Was Sie fuer die gravimetrische Kalibrierung brauchen
- eine Analysenwaage mit passender Ablesbarkeit und einer Verdunstungsfalle
- frisch destilliertes oder vollentsalztes Wasser, temperiert auf Raumtemperatur
- ein Thermometer fuer die Wassertemperatur sowie Werte fuer Luftdruck und Luftfeuchte
- die zu pruefende Pipette mit passenden, hochwertigen Spitzen
- ein kleines Wiegegefaess mit geringer Oeffnung, um Verdunstung zu begrenzen
Bedingungen nach ISO 8655
Damit die Ergebnisse vergleichbar sind, schreibt die Norm kontrollierte Bedingungen vor. Temperatur von Raum, Wasser und Pipette sollten angeglichen und waehrend der Messung stabil sein (ueblich sind rund 20 Grad Celsius, konstant auf etwa plus/minus 0,5 Grad). Der Arbeitsplatz muss zugfrei sein, die Luftfeuchte ausreichend hoch, um Verdunstung zu begrenzen. Geprueft wird bei mehreren Volumina, in der Regel 100 Prozent, 50 Prozent und 10 Prozent des Nennvolumens, mit jeweils zehn Wiegungen.
Anleitung: Pipette nach ISO 8655 kalibrieren
- Geraete akklimatisieren: Pipette, Spitzen und Wasser mindestens zwei Stunden im Wageraum temperieren.
- Waage vorbereiten: Analysenwaage nivellieren, Verdunstungsfalle einsetzen und tarieren.
- Bedingungen erfassen: Wassertemperatur, Raumtemperatur, Luftdruck und Luftfeuchte notieren.
- Spitze vorbenetzen: neue Spitze aufstecken und drei- bis fuenfmal aufziehen und abgeben.
- Pruefvolumina waehlen: meist 100, 50 und 10 Prozent des Nennvolumens.
- Zehn Wiegungen je Volumen: Wasser aufnehmen, an die Gefaesswand abgeben, Masse notieren, zuegig arbeiten.
- Masse in Volumen umrechnen: jede Masse mit dem Z-Faktor multiplizieren.
- Fehler berechnen: Richtigkeit und Wiederholpraezision ermitteln.
- Mit Fehlergrenzen vergleichen: gegen die Grenzwerte nach ISO 8655-2 pruefen.
- Justieren und erneut pruefen: bei Ueberschreitung justieren, wiederholen und dokumentieren.
Auswertung: systematischer und zufaelliger Fehler
Aus den zehn Volumenwerten je Pruefvolumen berechnen Sie zwei Kennzahlen:
Volumen aus der Masse: V = m × Z
Systematischer Fehler (Richtigkeit): e = V(Mittel) − V(Soll), in Prozent (e / V(Soll)) × 100
Zufaelliger Fehler (Wiederholpraezision): Standardabweichung s, Variationskoeffizient VK = (s / V(Mittel)) × 100
Der systematische Fehler zeigt, ob die Pipette im Mittel zu viel oder zu wenig abgibt. Der zufaellige Fehler zeigt, wie stark die Einzelwerte streuen. Beide muessen innerhalb der Fehlergrenzen liegen.
Der Z-Faktor kurz erklaert
Der Z-Faktor rechnet die gewogene Masse in ein Volumen um. Er beruecksichtigt die Dichte des Wassers und den Luftauftrieb bei der aktuellen Temperatur und dem aktuellen Luftdruck. Bei 20 Grad Celsius und normalem Luftdruck liegt er bei etwa 1,0032 Mikroliter pro Milligramm. Die genauen Werte fuer Ihre Bedingungen entnehmen Sie der Tabelle in ISO 8655-6.
Fehlergrenzen: wann besteht die Pipette?
Die zulaessigen Fehlergrenzen (maximal zulaessige systematische und zufaellige Fehler) haengen vom Geraetetyp und vom Nennvolumen ab und stehen in den Tabellen der ISO 8655-2. Als Faustregel gilt: je kleiner das Volumen, desto groesser die relativ zulaessige Abweichung. Vergleichen Sie Ihre berechneten Werte immer mit der aktuellen Tabelle der Norm oder mit den vom Hersteller angegebenen Grenzen.
Wie oft sollten Pipetten kalibriert werden?
Ein festes Intervall schreibt ISO 8655 nicht vor, es richtet sich nach Nutzung und Qualitaetsanforderungen. Ueblich ist eine vollstaendige Kalibrierung alle 3 bis 12 Monate, ergaenzt durch regelmaessige Zwischenpruefungen, zum Beispiel eine Schnellpruefung bei einem Volumen. In GLP- und GMP-Umgebungen legt die jeweilige SOP das Intervall fest.
Haeufige Fehler bei der Pipettenkalibrierung
- Spitze nicht vorbenetzt
- Wasser, Pipette und Raum nicht temperiert
- falsche Eintauchtiefe oder falscher Abgabewinkel
- zu langsames Arbeiten, sodass Wasser verdunstet
- keine Verdunstungsfalle auf der Waage
- abgenutzte Spitzen, Dichtungen oder Kolben
- Z-Faktor nicht an die tatsaechlichen Bedingungen angepasst
Haeufig gestellte Fragen
Was ist die ISO 8655?
ISO 8655 ist die internationale Norm fuer kolbenbetriebene Volumenmessgeraete wie Pipetten, Bueretten, Dispenser und Dilutoren. Sie legt Anforderungen, Fehlergrenzen und Pruefverfahren fest. Die gravimetrische Methode ist das Referenzverfahren.
Wie oft muessen Pipetten kalibriert werden?
Ueblich ist eine vollstaendige Kalibrierung alle 3 bis 12 Monate, je nach Nutzungshaeufigkeit und den QC-Vorgaben des Labors, ergaenzt durch regelmaessige Zwischenpruefungen. In GLP- oder GMP-Umgebungen richtet sich das Intervall nach der jeweiligen SOP.
Was ist der Z-Faktor?
Der Z-Faktor rechnet die gewogene Masse in ein Volumen um und beruecksichtigt die Dichte des Wassers sowie den Luftauftrieb bei der aktuellen Temperatur und dem Luftdruck. Bei 20 Grad Celsius und normalem Luftdruck liegt er bei etwa 1,0032 Mikroliter pro Milligramm. Die genauen Werte stehen in ISO 8655-6.
Was ist der Unterschied zwischen Kalibrieren und Justieren?
Kalibrieren bedeutet, die Abweichung der Pipette zu bestimmen. Justieren bedeutet, das Geraet so einzustellen, dass die Abweichung wieder innerhalb der Grenzen liegt. Kalibrieren stellt also fest, justieren korrigiert.
Welche Waage braucht man zum Kalibrieren von Pipetten?
Eine Analysenwaage mit einer zum Volumen passenden Ablesbarkeit und einer Verdunstungsfalle. Fuer sehr kleine Volumina im Mikroliterbereich ist eine Ablesbarkeit von 0,001 mg noetig, fuer groessere Volumina genuegt 0,1 mg. Die Waage selbst muss regelmaessig mit Pruefgewichten kalibriert sein.
Wie viele Messungen verlangt ISO 8655?
Pro Pruefvolumen werden zehn Wiegungen durchgefuehrt, in der Regel bei 100 Prozent, 50 Prozent und 10 Prozent des Nennvolumens. Aus den zehn Werten werden Richtigkeit und Wiederholpraezision berechnet.
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